低聚合度木聚糖对木聚糖酶合成的影响

研究了木聚糖的聚合度和添加黄豆粉对里氏木霉合成木聚糖酶的影响,并以纯化木聚糖酶水解木聚糖。研究结果表明:木聚糖经酶水解后平均聚合度降低54%,戊聚糖含量为75.4%。采用低聚合度木聚糖为底物碳源和添加黄豆粉都可提高产酶效果。以12g/L低聚合度木聚糖添加2g/L黄豆粉,培养3d后木聚糖酶活力可达到113IU/mL,提高49.3%。通过对木聚糖酶进行纯化处理可以有效除去β 木糖苷酶。以体积分数10%的木聚糖酶水解35g/L木聚糖3h后,低聚木糖得率达到35.5%,而木糖得率仅为1.5%,低聚木糖与总糖的比值达到95.8%,随着酶解时间的延长,低聚木糖不会被降解。     

绿色木霉内切葡聚糖酶基因Ⅰ的克隆表达

为深入研究绿色木霉(Trichoderma viride)内切葡聚糖酶(EGⅠ)的特性与功能,利用Northern blot方法分析不同碳源条件下绿色木霉的egⅠ表达,采用RT-PCR方法从绿色木霉T4中克隆egⅠ基因的cD-NA序列,测序与生物信息学分析,并构建诱导型表达载体pYES2-egⅠ,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1和H158中表达.结果表明:绿色木霉在含有纤维素的液体培养基中生长,egⅠ高效表达,在秸秆中表达量最高.纤维二糖中表达量相对较低,在葡萄糖、果糖中没有表达.egⅠ基因编码框长度1 377bp,编码459个氨基酸.含有信号肽,为分泌蛋白,属于糖苷水解酶家族7,具有纤维素酶结合域(CBD)和催化域(CD).INVSc1转化子发酵培养48 h达到转录高峰期,60 h达到酶活高峰期,酶活为0.081 6 U/mL,酶活比H158转化子提高32.5%.     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

黄绿木霉纤维素酶提纯及其性质研究

通过(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100分子筛层析和DEAE Sephadex A-50离子交换层析等步骤,分离纯化出木霉T2纤维素酶系中达到电泳纯的3种内切葡聚糖酶(EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ)和2种β-葡萄糖苷酶(BGⅠ、BGⅡ).通过SDS-PAGE和IEF电泳测得5个酶组分的相对分子质量分别为62.3 ku、71.9 ku、52.6 ku、85.3 ku和78.3 ku,等电点分别为5.4、4.8、5.0、5.6和5.8.此酶系均为糖蛋白,含糖量分别为17.7%、11.7%、15.6%、17.8%、19.3%.5个酶组分均属酸性纤维素酶,最适pH都是5.0;3种内切葡聚糖酶的最适温度皆为60℃,2种β-葡萄糖苷酶的最适温度都是55℃.Mn2 、Fe2 、Zn2 对5种纤维素酶都有一定的激活作用,尤其是Mn2 对内切葡聚糖酶的激活作用极为显著;Mg2 、Cu2 、脲对5种纤维素酶都具有不同程度的抑制作用.酶学动力学分析表明5种纤维素酶组分的Km值分别为0.093、0.083 8、0.079 0、0.085 1和0.077 8 mg/mL,Kcat值为101.7、119.6、11.4、111.4和162.1 s-1.内切葡聚糖酶对底物CMC-Na亲和力的大小与酶的催化效率之间并无相关性,BG对底物水杨苷亲和力的大小与酶的催化效率之间有一定的相关性.β-葡萄糖苷酶有较高的底物专一性,只对水杨苷有活力;内切葡聚糖酶在对羧甲基纤维素钠有活力的同时,对滤纸和秸秆粉也有微弱的活力.     

康氏木霉ZJ5纤维素酶发酵培养基的优化

采用响应面方法对康氏木霉(Trichoderma koningii)ZJ5生产纤维素酶的培养基进行了优化，首先通过全因子实验分析培养基组分；稻草粉、麦麸、大麦粉和(NH4)2SO4对纤维素酶三个组分活性的影响，确定主要影响因子为稻草粉和(NH4)2SO4，前者为正影响，后者为负影响，用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，利用中心组合设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度，在优化培养基中发酵6d，CMC酶活、滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活分别达到了765．8、155．3U／mL和39．54U／mL。     

一株里氏木霉产纤维素酶的条件及酶系的优化

对一株里氏木霉突变株液体发酵产纤维素酶的培养条件进行了优化,确定培养基的最适碳源和氮源种类及添加量(g/L)分别为:小麦秸秆15,小麦麸皮5,尿素10～15,(NH4)2SO412,NH4NO35;最适培养条件为:接种种龄72h,接种孢子悬液浓度2×107个/mL,培养温度30～32℃,pH值5 0,培养时间144h,摇瓶转速180r/min,装液量75mL/250mL三角瓶.在培养里氏木霉的培养基中同时接种黑曲霉(二者孢子数比为60∶1)进行混合培养,β 葡萄糖苷酶的产量是对照试验的2 9倍,明显改善了纤维素酶系的比例,提高了它们之间的协同作用效果,在最适培养条件下,粗酶液的β 葡萄糖苷糖活和FPA酶活分别达到127 6U/mL和84 8U/mL.     

N~＋注入诱变选育纤维素酶高产菌株及发酵产酶营养因子优化研究

应用低能氮离子（N＋）注入技术对纤维素酶产生菌里氏木霉（Trichoderma reesei）进行诱变选育,在能量为10 keV,注量为150×10^14和200×10^14N＋/cm^2的条件下分别筛选得到3株纤维素酶高产菌株,连续5代遗传稳定性实验结果表明,所得到的高产菌株遗传稳定性较好,羧甲基纤维素酶活力均提高到3.300 IU/mL以上,较出发菌株（2.698 IU/mL）提高了20.0%以上。采用Plackett-Burman实验设计法和旋转中心组合设计法系统地研究高产菌株150-1-1发酵营养因子组成,得到了纤维素酶产量随葡萄糖、麸皮和微晶纤维素等营养因子的变化规律及相应的响应面分析图。实验结果表明,葡萄糖、麸皮和微晶纤维素浓度与纤维素酶活存在显著的相关性,当葡萄糖浓度为4.9 g/L,麸皮浓度为23.0 g/L,微晶纤维素浓度为7.7 g/L时,150-1-1纤维素酶滤纸酶活力达到2.439 IU/mL,较优化前（2.000 IU/mL）提高了22.0%。     

Oil and fungal biomass dispersion in a stirred tank containing a simulated fermentation broth

The production of γ‐decalactone by the filamentous fungus Trichoderma harzianum involves four phases (oil–water–air–mycelium) and its dispersion is crucial during fermentation. Oil and biomass (when present) dispersion, as a function of the volumetric power drawn (P/V), was characterized, in two; three‐ and four‐phase systems agitated with Rushton turbines. Trichoderma harzianum mycelium was used as the solid phase in the four‐phase system. Two stages of the fermentation were simulated: the beginning (15% oil and 1.4 kgm^?3 of mycelium) and the end (2% oil and 10.6 kg m^?3 of mycelium). In the two‐phase system, the use of exhausted broth achieved higher oil dispersions at low P/V values as compared with distilled water. Aeration decreased the oil dispersion for the high‐oil system, but enhanced oil dispersion for the low‐oil system. Compared with the P/V used in the actual fermentation (0.2 kW m^?3), a high segregation of the system was observed for the high‐oil/low‐biomass system, due to the difficulty of mixing the thick oil–air emulsion present at the top of the tank. The system simulating the end of the fermentation reached almost complete homogeneity of oil and biomass, a phenomenon due to the high biomass/oil ratio and the biomass acting as an oil carrier. © 2001 Society of Chemical Industry